El grup de Long Li a l'Escola de Ciències de la Vida de la Universitat de Pequín va publicar un article titulat "Molecular pathway of mitocondrial preprotein import through the Molecular pathway of mitocondrial preprotein import through the TOM-TIM23 supercomplex", publicat a Nature Structural & Molecular Biology. L'estudi informa dels resultats estructurals i bioquímics del supercomplex TOM-TIM23 que media el transport de proteïnes als mitocondris, revela una nova via d'importació de proteïnes a través del complex TOM a través de la membrana externa mitocondrial i redefineix la composició bàsica del complex transportador TIM23 a l'interior. membrana mitocondrial.
Com un dels orgànuls més importants de les cèl·lules eucariotes, els mitocondris tenen un paper important en el subministrament d'energia, el metabolisme intracel·lular, l'homeòstasi i l'apoptosi. Els mitocondris tenen una estructura única de membrana lipídica de bicapa interna i externa, amb més d'1,000 proteïnes distribuïdes a l'interior. El 99% de les proteïnes mitocondrials estan codificades per gens citosòlics, sintetitzades en ribosomes del citoplasma i transportades a través de la membrana fins als mitocondris per dur a terme les seves funcions. Per tant, el transport de proteïnes mitocondrials és fonamental per mantenir i regular l'activitat mitocondrial, i les mutacions en gens relacionats estan estretament associades amb el desenvolupament de moltes malalties metabòliques i càncers en humans. El grup de Li Long ha estat treballant per explorar els mecanismes moleculars pels quals les proteïnes mitocondrials entren als mitocondris, i el treball publicat inclou la resolució de la via per la qual les proteïnes de la membrana mitocondrial entren a la membrana interna mitjançant el complex de transport TIM22 (Zhang Y. et al Cell Research 2021). El paper del supercomplex TOM-TIM23 en el transport de proteïnes mitocondrials és encara més important en aquest estudi. Aquest supercomplex, reunit a partir de desenes de subunitats proteiques, abasta les membranes de la bicapa mitocondrial interna i externa i controla el transport de més de 500 proteïnes mitocondrials solubles i de membrana. Durant els últims 40 anys, els investigadors han estudiat àmpliament i intensivament les subunitats individuals dels complexos de transport TOM i TIM23. No obstant això, a causa de la naturalesa altament dinàmica d'aquest supercomplex, la comprensió de la qüestió central de com s'assemblen aquestes subunitats per formar la via de transport de proteïnes encara és molt limitada, especialment per al complex TIM23 de la membrana endosòmica, on la composició del nucli. unitat de transport ha estat molt poc clara.
En aquest estudi, els autors van començar per primera vegada amb el muntatge d'un supercomplex TOM-TIM23 estable, van explorar diversos esquemes de muntatge i, finalment, van optar per fusionar proteïna fluorescent verda amb proteïna mitocondrial com a substrat de transport i van capturar l'estat intermedi del TOM-TIM23. supercomplex per transportar substrats proteics en cèl·lules de llevat. Després de la purificació in vitro, aquest estat intermedi encara es podria estabilitzar per a més estudis de biologia estructural i bioquímica. Mitjançant l'anàlisi d'un sol partícules d'aquest estat intermedi mitjançant microscòpia crioelectrònica, els autors van trobar que hi ha una interacció directa entre el complex TOM situat a la membrana externa i el complex TIM23 situat a la membrana interna, enllaçant les membranes mitocondrials interna i externa. , que lliura de manera eficient el substrat proteic des de la membrana mitocondrial externa a la membrana interna (Fig. 1a). En particular, el complex TOM es va resoldre amb una resolució de 4, 1 Å. L'estructura va revelar una "via dels aminoàcids polars" dins de la paret interna de la subunitat del canal Tom40, que es conserva entre espècies i media el pas del substrat proteic pel porus intermedi Tom40 en forma desplegada (Fig. 1b). Aquesta via és diferent de les dues vies transmembrana de Tom40 proposades anteriorment a partir d'experiments bioquímics, demostrant la versatilitat del complex TOM per reconèixer i transportar de manera eficient diverses proteïnes mitocondrials.
Fig. 1. Estructura del supercomplex TOM-TIM23. ( a ) Muntatge esquemàtic i estructura de microscòpia crioelectrònica del supercomplex TOM-TIM23. ( b ) Model estructural de microscòpia crioelectrònica del complex TOM que conté el substrat proteic. (c) Model estructural AlphaFold2 de l'heterotrímer Tim17-Tim23-Mgr2
A més, els autors van introduir sistemàticament aminoàcids no naturals a diferents llocs del substrat proteic i van sondar l'entorn del substrat proteic a la via de transport de TOM-TIM23 mitjançant la fotoreticulació, identificant així la subunitat central que ajuda directament el substrat a creuar el dues membranes lipídiques. Els resultats experimentals van mostrar que el fragment C-terminal del substrat proteic pot enllaçar-se amb la subunitat Tom40 de la membrana externa, un resultat coherent amb les observacions estructurals. Sorprenentment, però, el fragment N-terminal del substrat proteic s'enllaça amb les subunitats Tim17 i Mgr2 a la membrana interna, però no amb la subunitat Tim23, que s'identifica habitualment com a constitutiva del canal de transport de la membrana interna. Aquest resultat suggereix que hi pot haver un biaix significatiu en la percepció de la via de transport central del complex TIM23 en estudis anteriors. Per identificar encara més les subunitats i vies del transportador bàsic a TIM23, els autors van utilitzar una combinació de modelització AlphaFold2, enllaços bioquímics, genètica de llevats i transport in vitro de proteïnes mitocondrials, i van trobar que el component bàsic del complex TIM23 és un heterotrímer. format per les subunitats Tim23, Tim17 i Mgr2, amb Tim17 i Mgr2 cara a cara formen una estructura semblant a un canal, mentre que Tim23 s'uneix a Tim17 d'una forma adossada i no participa en la formació del canal (Fig. 1c). ). Durant la translocació de proteïnes, el substrat proteic passa per l'estructura semblant a un canal formada per Tim17 i Mgr2 i no entra directament en contacte amb la subunitat Tim23. Els experiments de mutagènesi van revelar que la derrota de Mgr2 al llevat no va afectar la translocació de proteïnes, cosa que suggereix que només es requereix Tim17 a l'estructura semblant a un canal formada per Tim17 i Mgr2. La raó per la qual Tim17 pot ajudar les proteïnes a creuar la membrana endosòmica es deu a la seva única distribució d'aminoàcids superficials: d'una banda, Tim17 té una regió de càrrega negativa molt conservada a l'entrada de la membrana endosòmica que pot alterar la localització. D'una banda, Tim17 té una regió de càrrega negativa molt conservada a l'entrada de la membrana interna. , que pot alterar l'estructura de la bicapa fosfolípid local i reduir la barrera energètica perquè les proteïnes travessin la membrana lipídica; d'altra banda, Tim17 té una regió hidrofòbica conservada al centre de la via, que ajuda a mantenir la membrana interna del mitocondri en un estat hermètic i a mantenir el potencial de membrana necessari per a les activitats fisiològiques mitocondrials. Tenint conjuntament els resultats de diversos experiments estructurals i bioquímics, es pot concloure que el complex TIM23, amb la subunitat Tim17 al nucli, adopta un mode mixt per ajudar a la translocació de proteïnes, és a dir, Tim17 es pot unir dinàmicament amb altres subunitats per formar una canal per ajudar les proteïnes a través de la membrana, o Tim17 treballa en el mode de treball de l'enzim d'inserció per aconseguir la translocació de proteïnes sols sense necessitat de formació de canals. Aquest resultat corregeix la percepció errònia del camp durant els darrers 40 anys que la subunitat Tim23 constitueix un canal central.
En resum, aquest estudi va desenvolupar una nova estratègia per als estudis de transport de proteïnes, va revelar la via crítica perquè les proteïnes mitocondrials travessin la membrana lipídica de bicapa mitjançant el supercomplex TOM-TIM23 (figura 2), va anul·lar el coneixement de camp de llarga data dels components bàsics de el complex de transport TIM23 de la membrana interna i va descobrir un mode completament nou de funcionament de l'enzim de transport de proteïnes, que estableix una base sòlida per a una comprensió completa i profunda de la biosíntesi mitocondrial. síntesi, establint una base sòlida per a una comprensió completa i profunda de la biosíntesi mitocondrial.
Figura 2. via transportadora mitocondrial TOM-TIM23
Long Li és l'autor corresponent del document, i Xueyin Zhou, estudiant de doctorat de la classe de Ciències de la Vida de la Universitat de Pequín i Tsinghua del 2018, Yuqi Yang, estudiant de doctorat de la classe de l'Escola de Ciències de la Vida del 2019, el Dr. Peng Wang de la plataforma de microscòpia crioelectrònica de la Universitat de Pequín i Shanshan Wang, estudiant de doctorat de la classe de l'Escola de Ciències de la Vida del 2020, són els co-primers autors. Dongjie Sun, un antic tècnic del laboratori de Li Long, Xiaomin Ou, estudiant de doctorat a la Facultat de Ciències de la Vida, promoció de 2022, i Yuke Lian, estudiant de doctorat a la Facultat de Ciències de la Vida, promoció de 2021, van fer contribucions significatives a aquesta investigació. El professor Ning Gao i l'investigador associat Ningning Li de l'Escola de Ciències de la Vida de la Universitat de Pequín i l'investigador Xinzheng Zhang de l'Institut de Biofísica de l'Acadèmia Xinesa de Ciències, van oferir una gran ajuda en el càlcul de dades de microscòpia crioelectrònica, i el professor Qing Li i el professor Gain Chang de l'Escola de Ciències de la Vida de la Universitat de Pequín, va proporcionar una orientació important sobre la genètica de llevats i els experiments de fotoreticulació, respectivament. El treball de recerca va comptar amb el suport de la plataforma de microscòpia crioelectrònica de la Universitat de Pequín, el Centre d'Informàtica d'Alt Rendiment, el Centre d'Instrumentació de l'Escola de Ciències de la Vida i la Plataforma Nacional de Proteïnes de Phoenix, i va ser finançat pel Laboratori Estatal de Biologia de Membranes, el Centre Conjunt de la Universitat de Pequín i Tsinghua. per a Ciències de la Vida i la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina.
